از ابتدای انقلاب اسلامی او یکی از اعضای سپاه پاسداران بود. او بعدتر از مخالفان ادامه جنگ با عراق بعد از فتح خرمشهر بود و در سال ۱۳۶۲ طی یک سخنرانی علنی در پادگان ولی‌عصر و در حضور «محسن رضایی» فرمانده وقت سپاه پاسداران، به سیاست ادامه جنگ اعتراض کرد و آن را بی‌فایده دانست. 

او در همان سخنرانی که باعث بحرانی شدید در سپاه شد، فرماندهان سپاه از جمله «محسن رضایی، محسن رفیق‌دوست، محمدباقر ذوالقدر و زیبایی‌نژاد» را متهم کرد که سپاه را آلت دست سازمان مجاهدین انقلاب اسلامی کرده‌اند و با نیروی نظامی سپاه کار سیاسی می‌کنند و خواستار برکناری فرمانده سپاه شد.

این سخنرانی با استقبال نیروهای لشکر محمدرسول‌الله سپاه مواجه و در نتیجه باعث تنش میان آنان با فرماندهی سپاه شد. 

سپاه این برخورد را تمرد در شرایط جنگی دانست و برای گنجی خواستار اشد مجازات یعنی حکم اعدام شد، اما با وساطت آیت‌الله منتظری و یوسف صانعی این موضوع منتفی شد.

اکبر گنجی در سال ۱۳۶۳ از سپاه پاسداران انقلاب اسلامی استعفا داد. او بعد از کنار رفتن از سپاه، چند سالی رابط فرهنگی سفارت ایران در ترکیه بود.

آقای گنجی از اوایل دهه هفتاد به «حلقه کیان» پیوست. در واقع محمد خاتمی، ماشاالله شمس الواعظین و دیگر اعضای اصلاح‌طلب روزنامه کیهان پس از جدا شدن از روزنامه کیهان نشریه‌ای به نام «کیان» را منتشر کردند و اکبر گنجی نیز یکی از اعضای ثابت این نشریه شد. 

با پیروزی محمد خاتمی در انتخابات ریاست جمهوری سال ۱۳۷۶، یاران او که اکبر گنجی نیز در میان‌شان بود، به نام «اصلاح‌طلبان» شهرت یافتند.

او کتاب‌های معروف «تاریکخانه اشباح» و «عالیجناب سرخپوش و عالیجنابان خاکستری» در اواخر دهه ۷۰ و اوایل دهه ۸۰ نوشت. کتاب‌های که درباره پرونده قتل‌های زنجیره‌ای و افشای برخی از عوامل پشت پرده در جمهوری اسلامی است که  آنان را در مظان اتهاماتی چون قتل مخالفان، فساد گسترده اقتصادی و اخلاقی و هم چنين سرکوب مخالفان داخلی و خارجی قرار می‌داد. 

کتاب  «عالیجناب سرخپوش و عالیجنابان خاکستری» که در سال ۱۳۷۹ منتشر شد در مدت تنها ۲ سال در ایران ۵۴ بار تجدید چاپ شد. با این حال با وقوع ماجرای کنفرانس برلین و دستگیری و محاکمه اکبر گنجی از انتشارات بعدی کتاب جلوگیری شد و هم‌اینک این کتاب و کتاب «تاریکخانه اشباح» او جزو کتابهای بی‌مجوز محسوب می‌شوند.
 
اکبر گنجی یکی از شرکت‌کنندگان در کنفرانس «ایران پس از انتخابات» بود که بعدتر به کنفرانس برلین معروف شد. این کنفرانس از ۱۹ تا ۲۱ فروردین ماه ۱۳۷۹ به همت بنیاد هاینریش بل و مدت سه روز در برلین برگزار شد. اما صداوسیما با پخش گزیده‌های از مصاحبه‌ سخنران‌های ایرانی در این نشست به آن ابعاد سیاسی داد.
 
در این فیلم‌ها صحنه‌های از عریان شدن یک مرد، رقصیدن یک زن، فریادهای مرگ بر جمهوری اسلامی نیز پخش شد. پس از آن تمام شرکت‌گنندگان در این کنفرانس احضار و بازجویی شدند.
 
اکبر گنجی در دادگاه به ریاست «سعید مرتضوی» به اتهام شرکت در کنفرانس برلین و اتهامات دیگر امنیتی محاکمه و پس از آن به ۱۰ سال حبس و ۵ سال تبعید محکوم شد. دو سال بعد دادگاه تجدیدنظر این حکم را به ۶ ماه حبس کاهش داد. اما مجددا دادستانی تهران نسبت به رای دادگاه تجدیدنظر اعتراض کرد و این بار آقای گنجی به ۶سال زندان محکوم شد. او ۶ سال کامل را در زندان گذراند.
 
اکبر گنجی هنگام حضور در دادگاه، علنا «علی فلاحیان» وزیر اطلاعات دولت اکبر هاشمی رفسنجانی را شاه‌کلید قتل‌های زنجیره‌ای نامید، و از روحانیون دیگری نیز نام برد؛ از جمله «محمدتقی مصباح یزدی» که او را محرک و صادرکننده فتوای قتل‌ها یا به اصطلاح «مراد عالیجنابان خاکستری» خواند.
گنجی در سال ۱۳۸۱ در حالی که در زندان بود جزوه‌ای به نام «مانیفست جمهوری‌خواهی» را نوشت که در آن ناکارآمدی جنبش اصلاحات در نظام جمهوری اسلامی ایران و راه‌های خروج از بن بست توسط جمهوری‌خواهی به بحث گذاشته شده‌ بود

او  برای 13 روز دست به اعتصاب غذا در اعتراض به نداشتن مرخصی زد و اعلام کرده بود این اعتصاب غذا نامحدود خواهد بود که در نهایت با موافقت با مرخصی اش ، اعتصاب غذایش را شکست. 

این روزنامه نگار، پس از بازگشت به خانه، در مصاحبه‌هایی با خبرگزاری‌های بین‌المللی رسما به ‌شدت از جدایی کامل دین از سیاست و تاسیس یک جمهوری تمام عیار به جای جمهوری اسلامی دفاع کرد. 

همین صحبت ها باعث شد تا دوباره او را به زندان بازگردانند. گنجی مجددا به مدت 70 روز دست به اعتصاب غذا زد.

در این مدت بسیاری از ایرانیان در سراسر جهان، و همچنین سران کشورهای غربی به حمایت از او برخاستند. «جرج دبیلیو بوش» رئیس‌جمهور آمریکا، «تونی بلر» نخست‌وزیر انگلستان و «کوفی عنان» دبیرکل سازمان ملل متحد، از جمله شخصیت‌های بین‌المللی بودند که خواهان آزادی اکبر گنجی شدند.

در پی وخامت اوضاع جسمی و پس از انتشار عکس‌هایی از اکبر گنجی که وی را در حالتی رنجور در زندان نشان می‌داد، سعید مرتضوی، دادستان وقت  دستور انتقال گنجی را به بیمارستان میلاد صادر کرد.

اکبر گنجی چند ماه پس از اینکه از دوره ۶ سال زندان خود آزاد شد، ایران را ترک کرد.

گنجی در ابتدا، سفر خود را موقتی نامید و گفت به کشورش باز خواهد گشت. او در همین مدت جایزه قلم طلایی انجمن جهانی روزنامه‌نگاران را در کاخ بزرگ کرملین روسیه دریافت کرد، و پس از آن به ایتالیا رفت و درفش نقره‌ای شهر فلورانس را گرفت. رئیس پیشین دادگاه بین‌المللی جنایت‌های جنگی، او را با «نلسون ماندلا» و «واسلاو هاول» مقایسه کرد و نمایندگان شهر فلورانس او را از سلسله راهگشایان آزادی دانستند که فضای استبداد را می‌شکند.

پس از آن به فرانسه، آمریکا و کانادا رفت و جوایز متعدد دیگری را نیز دریافت کرد و در بسیاری از دانشگاه‌های آمریکا و کانادا، و همچنین در پارلمان اروپا سخنرانی کرد.

همچنین 7 دسامبر ۲۰۱۰ میلادی، اکبر گنجی در مصاحبه‌ای با بخش فارسی بی‌بی‌سی افشا کرد که؛ «قتل‌های زنجیره‌ای ایران پروژه‌ای حکومتی بود و رهبر ایران پشت ماجرا قرار داشته، و با دستور مستقیم علی خامنه ای، ماموران وزارت اطلاعات به ترور مخالفان نظام جمهوری اسلامی در داخل و خارج از کشور روی آوردند.»